三代测序技术凭借其长读长，无需PCR扩增等特点，成为了基因组测序领域的研究热点，高分文章频发。PacBio和Nanopore是三代测序的两大主流平台。那么，三代测序技术除了被应用于SV检测，还可做哪些分析呢？小编在这里为大家介绍一下三代测序技术在疾病研究中的四大热点技能，包括STR、HLA、单体型和甲基化分析，以期为您的科研提供助力。
多技能展示01技能1——重复序列STR分析
短串联重复序列（shorttandemrepeat，STR），指人基因组上由~6个碱基单元组成的一段重复序列。基因组中的STR在某些情况下会发生动态突变。所谓动态突变，是指DNA中的重复序列拷贝数发生不稳定的持续扩增的一类突变[1]。与NGS技术相比，三代长读长测序技术可轻松跨越基因组低复杂度区域，且无GC偏好性，更利于STR的分析。目前，研究发现已有二十多种遗传性疾病是由三核苷酸重复序列异常扩增引起的。常见的有亨廷顿舞蹈病（HD）、脆性X综合征和强直性肌营养不良等[]。诺禾致源采用RepeatHMM[3]软件进行STR检测。
案例展示Long-readsequencingidentifiesGGCrepeatexpansionsinNOTCHNLCassociatedwithneuronalintranuclearinclusiondisease[4]
期刊：NatureGenetics
影响因子：5.
发表日期:年7月
研究结果
本研究通过二代测序技术（WGS和WES）的连锁分析将致病位点定位在1p36.31-p36.约3.5Mb区域和1p.1-q1.3约58.1Mb区域内（图1）。随后利用三代测序平台对来自8个家庭的13个患者和4例正常个体进行了全基因组测序，测序结果表明，13个患者在chr1:-处都有GGC重复扩增。后续采用RP-PCR和CRISPR–Cas9技术进行了验证。本研究最终利用长读长测序解析了神经元核内包涵体病（neuronalintranuclearinclusiondisease,NIID）三核苷酸重复序列特异性扩增的致病机制，阐述了NOTCHNLC基因5’UTR区域中GGC和GGA的三核苷酸高度扩张与NIID疾病发生发展相关（图）。
图1连锁分析结果图
图NOTCHNLC基因示意图
0技能——HLA分析
HLA(HumanLeucocyteAntigen)，人类白细胞抗原，是位于人类6号染色体（6p1.3）的一段约3.6M的区域，约有60个基因，该区域是复杂的、高度多态性的、紧密连锁的基因群，可作为一个遗传单位、单倍体传给下一代，属共显性等位基因。NGS技术受读长的限制，导致HLA分型数据不明确，如，任何两个等位基因如果只在比NGS最大读长更远的区域存在差异，则不能进行分型。三代技术凭借其长读长特点，能够减少这种潜在的歧义/错误的分析情况。目前，已报道超过种疾病和HLA相关，涉及自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病、过敏性疾病、感染类疾病、代谢性疾病等，如糖尿病、类风湿性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎等[5]。诺禾致源使用HLA-LA[6]软件进行HLA分析。
案例展示AnalysisofHLA-Glong-readgenomicsequencesinmother-offspringpairswithpreeclampsia[7]
发表期刊：ScientificReports
影响因子：3.
发表时间：00年11月
研究结果
本研究通过PacBioRSII测序数据与IPD-IMGT/HLA数据库中HLA-G序列进行比对（Sanger进行验证），明确发现了个没有与已知数据库中比对上的consensussequences（图3）。HLA-G等位基因的分布在先兆子痫（preeclampsia,PE）和对照组母子对之间没有显著差异（Fisher’sexacttest.p0.05），这表明已知的单一多态性位点在HLA-G核心区不影响PE起病。HLA-G*01:01:01:01等位基因具有较短的下游polyT拉伸，在PE发病中起作用（表1）。
图3HLA-G的条新发现的allele
表1HLA-G下游polyT拉伸在PE患者和正常人中的差异分析
03技能3——单体型分析
单体型（Haplotype），也被称为单倍型、单元型，是指位于一条染色体上或某一区域的一组相关联SNP的等位位点组合，一般其连锁紧密，不发生重组，并倾向于整体传递给后代。单体型分析（Haplotyping），也称为定相（Phasing），即从无序的，未定相的基因型数据确定单倍体DNA序列（单体型）的过程。以Illumina平台为代表的二代测序，由于插入片段长度的在bp，而一般人类每两个SNP之间的距离在1.5Kb左右，因此在分型时会有不准确，以及部分片段无法分型的情况，三代测序在长读长上的优势更适用于跨越多个SNP位点来进行分型。诺禾致源采用WhatsHap[8]软件进行单体型分析。
案例展示Sequencingofhumangenomeswithnanoporetechnology[8]
发表期刊：Nature